Explore the vast range of titles available.

目的 构建RWD结构小泛素化增强子（RWDD3）shRNA慢病毒表达载体,为探讨RNA干扰技术抑制人脑胶质瘤细胞RWDD3基因的相关研究奠定基础。方法 设计RWDD3的3条siRNA的靶点序列,合成含干扰序列的双链DNA发卡结构shRNA,分别与双酶切后的载体连接,构建3种重组质粒pGC-LV-shRNA1、pGC-LV-shRNA2和pGC-LV-shRNA3,并转化于DH5α感受态细胞,提取阳性克隆质粒测序,转染293T细胞,生产慢病毒颗粒,并检测病毒滴度。将3种重组慢病毒及阴性对照病毒分别感染人脑胶质瘤细胞U251,实时定量PCR和Western blot分别检测RWDD3mRNA和蛋白的沉默效果。结果 测序结果证实3种慢病毒载体均包装成功,滴度分别为5×10^11 TU/L、4×10^11 TU/L、5×10^11 TU/L。感染U251后,RWDD3mRNA及蛋白的表达量均较阴性对照组和未感染组明显降低（P〈0.05）;其中以LV-RWDD3-shRNA-1作用显著,mRNA表达下调79.2%,蛋白表达下调68.2%（P〈0.05）;而阴性感染对照组和未感染组相比差异无统计学意义（P〉0.05）。结论 成功构建3种RWDD3shRNA慢病毒表达,可有效下调U251细胞RWDD3mRNA和蛋白的表达,其为进一步研究以RWDD3为靶点的脑胶质瘤基因治疗提供稳定转染细胞的载体奠定基础。

目的探讨Tmub1蛋白在肝细胞增殖中的作用。方法分别使用Tmub1沉默慢病毒载体、Tmub1过表达慢病毒载体及对应的空载体转染大鼠BRL-3A肝细胞,得到稳定转染的细胞。转染后采用Western blotting检测Tmub1蛋白的表达,MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞周期。结果转染LV-Tmub1慢病毒的肝细胞Tmub1蛋白表达明显增加,转染LV-Tmub1-RNAi慢病毒的肝细胞Tmub1蛋白表达明显降低,与正常肝细胞比较,差异均有统计学意义（P〈0.01）。转染LV-Tmub1慢病毒的肝细胞增殖最快,转染LV-Tmub1-RNAi慢病毒的肝细胞增殖最慢,两组之间差异有统计学意义（P〈0.01）。过表达Tmub1慢病毒载体转染的肝细胞的G2＋S期明显长于沉默Tmub1慢病毒载体转染的肝细胞,差异有统计学意义（P〈0.01）。结论 Tmub1蛋白可促进BRL-3A肝细胞的增殖。

目的观察慢病毒载体介导的增强型绿色荧光蛋白（LV-EGFP）经不同浓度和途径转染大鼠角膜的转染效率及毒性，探讨慢病毒转染角膜的最佳途径。方法25只SD大鼠，随机分为5组。A组为感染复数（MOI）=5点眼组，B组为MOI=5结膜下注射组，C组为MOI=10点眼组，D组为MOI=10结膜下注射组，E组为MOI=10离体转染组，各组予以相应浓度LV-EGFP。7d后取转染后角膜于荧光显微镜下观察荧光分布，并分析荧光强度；HE染色观察转染后角膜细胞病理改变。结果荧光显微镜观察显示，相同MOI组之间比较，点眼方式的角膜荧光分布较结膜下注射方式均匀。各组相对荧光强度值分别为：A组0．1803±0．0440，B组0．1061±o．0434，C组0．2369±o．0157，D组0．2002±0．0307，E组0．2434±0．0173，点眼方式的角膜荧光强度高于结膜下注射方式（P〈o．05），且MOI增加时EGFP表达增强（P〈0．05）。E组荧光强度明显高于A、B、D组（P〈0．05），但与C组比较差异无统计学意义（P〉0．05）。HE染色显示各组角膜细胞形态正常，未见明显凋亡细胞。离体转染角膜经过7d培养液转染后，角膜内皮细胞生长良好，未出现皱缩、变形及缺失等病理改变。结论LV-EGFP可在较低MOI下有效转染大鼠角膜，且持续转染的安全性良好；点眼方式的转染效率高于比结膜下注射，提高MOI能提高角膜转染的效率。

慢病毒载体（lentivirus vector, LV）是目前分子及细胞生物实验中非常有效的工具，在基因转染方面有着许多独特的优势，例如，对细胞是否处于有丝分裂期没有特别的要求，基因转染效率高，可容纳较大基因片段等。本文将就慢病毒载体的来源、分子特征及研究进展等进行综述。

背景与目的 nm23-H1基因是重要的肿瘤转移抑制基因。前期研究发现利用化学合成的小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）抑制nm23-H1基因的表达可明显增强肺癌细胞的侵袭力。为了进一步研究nm23-H1基因沉默后的分子生物学机制,本研究利用慢病毒介导的短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）建立nm23-H1基因稳定沉默的肺癌细胞株。方法将表达特异性抑制nm23-H1基因shRNA的慢病毒转染人大细胞肺癌细胞株NL9980和肺腺癌细胞株A549,通过嘌呤霉素筛选出稳定转染细胞株。逆转录PCR、定量PCR及Western blot法检测nm23-H1基因表达,并通过shRNA抵抗的nm23-H1基因重组质粒转染拯救实验验证,侵袭小室实验检测侵袭力改变。结果逆转录PCR、定量PCR和Western blot法检测稳定转染细胞株NL9980-99和A549-99中nm23-H1基因在mRNA和蛋白水平表达均明显降低;shRNA抵抗的nm23-H1基因重组质粒转染拯救实验重现nm23-H1的正常表达;侵袭小室实验显示NL9980-99和A549-99细胞侵袭力明显增强。结论成功建立nm23-H1基因稳定沉默的人大细胞肺癌细胞株NL9980-99和人肺腺癌细胞株A549-99,nm23-H1基因沉默后使NL9980-99和A549-99细胞的侵袭力明显增强。

背景与目的CDl47是一类位于肿瘤细胞膜表面的跨膜糖蛋白，可促进肿瘤的浸润和转移。本研究拟构建CDl47慢病毒表达载体，建立稳定过表达CDl47的人肺腺癌A549细胞系，观察过表达CD147后对MMP-9及细胞增殖、侵袭能力的影响。方法RT-PCR扩增CD147基因全长序列，将序列插入pEGFP载体，构建pEGFP-CD147慢病毒表达载体，随后转入293FT细胞中进行慢病毒包装，用获得的慢病毒毒液感染人肺腺癌细胞系A549，建立稳定过表达CD147的A549细胞系。Real-timePCR检测MMP-9的变化情况，CCK-8及Transwell法检测人肺腺癌细胞增殖、侵袭能力的变化。结果经限制性内切酶鉴定及测序分析，成功构建TpEGFP-CDl47慢病毒表达载体质粒。Real．timePCR和Westernblot检测显示，与对照组相比，转染pEGFP-CDl47慢病毒表达载体组的细胞，CD147的表达在mRNA和蛋白两个水平均增高，成功建立了A549-CDl47细胞系。上调CD147的表达后，MMP．9的mm姐表达水平明显升高。同时，A549-CD147细胞增殖和侵袭能力明显增加（P〈0．05）。结论成功构建CD147慢病毒表达载体和A549-CD147细胞系，过表达CD147可上调MMP-9的表达，增强人肺腺癌细胞的增殖和侵袭能力。

目的 探讨慢病毒介导的CXCR7-shRNA转染人结肠癌细胞株SW620后对CXCR7蛋白表达的影响.方法 ①设计并合成CXCR7的3对shRNA序列及1对阴性对照序列,与pSilencerTM4.1系统合成构建重组慢病毒载体,转染HEK293T细胞包装病毒并检测滴度;②将3种重组慢病毒载体及阴性对照分别感染人结肠癌细胞SW620,RT-PCR检测CXCR7 mRNA的表达情况,测定沉默效率,筛选沉默效率最高的一组CXCR7-shRNA作为后续实验的表达载体;③MTT法检测转染CXCR7-shRNA对SW620细胞生长增殖的影响;④细胞划痕实验检测转染CXCR7shRNA对SW620细胞侵袭迁移能力的影响;⑤Western blot检测转染CXCR7-shRNA对SW620细胞蛋白表达情况.结果 ①测序证实3对慢病毒载体及1对阴性对照载体均包装成功,滴度分别3.16×108 pfu/mL、4.27×108 pfu/mL、3.93×108 pfu/mL和2.95×108 pfu/mL;②3组慢病毒载体转染SW620细胞后,CXCR7 mRNA的表达量均较阴性对照组明显降低（P＜0.05）,其中CXCR7-shRNA-1对CXCR7的抑制率明显高于其他两组（P＜0.05）;③CXCR7-shR-NA-1转染SW620后,肿瘤细胞的增殖程度显著减少,与空白组相比有统计学差异（P＜0.05）;④SW620细胞在划痕24 h后,空白对照组和实验组的细胞迁移指数（MI）分别为（49.92±6.41）％和（29.13±5.38）％,差异有统计学意义（P＜0.05）,划痕48h后,对照组与实验组的MI分别为（96.52±7.44）％和（72.03±8.29）％,差异有统计学意义（P＜0.05）;⑤CXCR7-shRNA-1转染SW620细胞后,与空病毒载体组、空白组相比,CXCR7蛋白表达量明显降低,具有统计学意义（P＜0.05）.结论 CXCR7被沉默后可有效抑制SW620肿瘤细胞的增殖与迁移,这为后续研究以CXCR7/CXCL12生物学轴为靶点的肿瘤基因治疗打下良好基础.

背景与目的 N端截短的羧肽酶E（N-terminal truncated carboxypeptidase E, CPEΔN）是一个新的肿瘤转移相关蛋白。本研究旨在筛选高表达CPEΔN的H1299肺癌细胞株，为完成小鼠活体成像实验创造条件。方法构建CPEΔN的慢病毒表达载体。分别用CPEΔN慢病毒表达载体或对照慢病毒空载体转染H1299细胞，2μg/mL的嘌呤霉素加压筛选。Western blot分析CPEΔN蛋白的表达，荧光素酶报告基因实验分析荧光素酶对底物的分解作用。结果当感染倍数（multiple of infection, MOI）是20时，慢病毒对H1299细胞的转染效率可以达到80%。CPEΔN高表达H1299细胞株（H1299-CPEΔN）和对照慢病毒载体表达H1299细胞株（H1299-control）中CPEΔN蛋白的表达量为4：1。H1299-CPEΔN和H1299-control均能够有效分解荧光素酶底物，可以满足活体成像实验的需求。结论筛选出高表达CPEΔN的H1299肺癌细胞株，为活体成像实验的开展创造了条件，也为进一步解释CPEΔN促进肿瘤转移的分子机制奠定了基础。

目的探讨慢病毒介导的骨形态发生蛋白-2（BMP-2）治疗骨质疏松骨折的效果。方法建立30只大鼠骨质疏松模型并进行分组。模型组和BMP-2治疗组（即BMP-2组）进一步制作左胫骨中段横行骨折模型,并于骨折当天在骨折局部分别皮下注射对照病毒和BMP-2质粒的慢病毒,而对照组不作骨折处理,只在相应部位皮下注射等体积的PBS。4d后分别处死各组3只大鼠,用Western blot检测骨折局部皮下BMP-2的表达情况;治疗8周后处死其余大鼠,取左胫骨进行X线检查并评分,测定骨密度及骨的生物力学指标,观察骨痂组织学变化。结果 BMP-2组大鼠骨折处皮下组织BMP-2蛋白表达水平明显高于对照组和模型组（P〈0.05）。模型组和BMP-2组大鼠胫骨X线评分与对照组比较,明显降低（P〈0.05）,但是BMP-2组明显高于模型组（P〈0.05）。模型组和BMP-2组大鼠骨密度明显低于对照组,而BMP-2组明显高于模型组（P〈0.05）。模型组和BMP-2组大鼠胫骨3点弯曲参数（最大载荷、最大应力、破坏载荷和破坏应力）与对照组大鼠比较,均明显下降,而BMP-2组各参数较模型组明显升高（P〈0.05）。骨痂组织HE染色显示,模型组大鼠软骨性骨痂较多,骨小梁较细,排列稀疏紊乱,而BMP-2组大鼠可见大量软骨性骨痂向骨性骨痂转变,新生形成大量编织骨小梁。结论慢病毒介导的BMP-2能促进骨形成,促进骨折部位愈合,对骨质疏松性骨折具有很好的治疗效果。

背景与目的 Survivin是凋亡抑制蛋白（inhibitor ofapoptosis protein,IAP）家族的成员,在多种肿瘤组织中高度表达而在终末分化细胞中极少表达,因此可以作为癌症治疗的理想靶点。本研究旨在通过构建Survivin基因shRNA的慢病毒质粒并干扰肺癌细胞A549中Survivin的表达,分析其对细胞增殖的影响。方法设计Survivin干扰靶序列,构建重组质粒;将pLL3.7-Survivin转染293T细胞后利用Hela细胞检测病毒的滴度并感染A549细胞,应用RTPCR和Westernblot检测干扰效果;MTT与流式细胞术分析其对细胞增殖的影响。结果本研究成功构建了重组质粒;重组质粒可抑制A549细胞中Survivin基因的表达;细胞受阻于G_2/M期。结论本研究构建的重组质粒可抑制Survivin基因的表达并影响细胞的增殖,其为研究RNAi介导的肺癌基因治疗打下基础。