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目的 探讨细胞穿透肽Tat-LK15介导siRNA干扰大鼠脊髓背角神经元型一氧化氮合酶(nNOS)表达对神经病理性疼痛的治疗效应。方法 采用Tat-LK15介导FAM-siRNA转染原代大鼠脊髓背角神经元细胞(RN-dsc),于倒置荧光显微镜观察其转染效果。健康雄性SD大鼠50只,随机分为5组(n=10):正常组、假手术组、神经病理性疼痛组(SNL组)、Tat-LK15-nNOS siRNA组(TS组)和Tat-LK15-NC siRNA组(TN组)。采用脊神经结扎法(SNL)制作神经病理性疼痛模型,正常组不予任何处理,假手术组仅暴露脊神经;SNL组、TS组、TN组构建SNL模型同时鞘内置管,于第7天开始每天分别鞘内注射10μl生理盐水、10μl含5μg siRNA的Tat-LK15-nNOS siRNA和Tat-LK15-NCsiRNA,持续7d。建模前1d及建模后3、7、10、14d测定各组大鼠机械缩足反应阈值(PWMT)及热缩足反应潜伏期(PWTL)。第14天测定结束后取L4-6节段脊髓,采用q-PCR及Western blotting检测脊髓背角nNOS表达水平。结果 倒置荧光显微镜观察显示,Tat-LK15可成功介导siRNA转染原代大鼠脊髓背角神经元。与假手术组比较,SNL组建模后第3天起PWMT降低、PWTL缩短,脊髓背角nNOS mRNA及蛋白表达上调(P<0.01),正常组上述指标与假手术组比较差异无统计学意义;与SNL组比较,TS组第10、14天时PWMT增高、PWTL延长,脊髓背角nNOS mRNA及蛋白表达降低(P<0.01),TN组上述指标与SNL组比较差异无统计学意义。结论 Tat-LK15可成功介导nNOS siRNA转染脊髓背角神经元,沉默nNOS基因的过度表达,对SNL大鼠神经病理性疼痛具有一定的治疗作用。

肺癌相关死亡是世界范围内癌症导致死亡的最常见原因。非编码RNA无蛋白编码功能,但可发挥多种生物学作用。长链非编码RNA是最新表征的一种至少包含200个核苷酸且不编码蛋白的RNA。多种长链非编码RNA具有促进或抑制肿瘤进展的功能,包括非小细胞肺癌。由于他们在调节基因表达方面的基本作用并涉及肿瘤发生的生物学机制,有望成为以组织或血液为基础的癌症生物标志物。在该综述中,我们着重强调lnc RNA在非小细胞肺癌中的作用,并讨论其作为诊断及预后标志物、治疗靶标的潜在临床应用。

[目的]为了构建松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）果胶酶Bxpel2基因干扰载体。[方法]通过Trizol法提取松材线虫总RNA,反转录合成c DNA,设计带T7启动子的果胶酶Bxpel2基因引物,以c DNA为模板扩增出果胶酶Bxpel2基因片段,连接到RNA干扰载体,再以干扰载体为模板,PCR扩增出目的片段后进行测序鉴定,合成果胶酶Bxpel2基因双链RNA（dsRNA）,采用RT-PCR检测松材线虫Bxpel2基因干扰后的表达情况。[结果]表明：1）提取的松材线虫总RNA完整性好,无降解;2）成功克隆出松材线虫果胶酶Bxpel2基因片段（790 bp）并将其连接至p MD19-T载体;3）以RNA干扰载体为模板合成dsRNA,浓度分别为1.313 mg·m L-1和1.152 mg·m L-1;4）RT-PCR结果显示,松材线虫经过dsRNA干扰后,Bxpel2基因表达基本受到抑制。[结论]成功构建松材线虫果胶酶Bxpel2基因干扰载体,为进一步研究Bxpel2基因在松材线虫致病过程中的作用和功能奠定了良好的基础。

目的构建及筛选有效干扰大鼠血管平滑肌细胞PER2基因的shRNA慢病毒载体，并测定其干扰效率。方法设计大鼠PER2的siRNA靶序列，插入慢病毒载体质粒pGLV—U6一EGFP中，构建pI，entivirus—per2-rat表达重组体并转染至A7r5大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞内，利用Real—timePCR方法检测PER2基因的mRNA表达水平，筛选有效沉默钟基因PER2表达的RNAi慢病毒载体。结果经电泳、基因测序证实插入的目的序列正确，有PER2表达，成功构建了pLentivirus—per2-rat表达重组体；转染慢病毒载体pLentivirus—per2-rat至A7r5大鼠胸血管平滑肌细胞，测定转染效率达70％；Real—timePCR检测PER2基因的mRNA相对表达量，筛选出有效干扰大鼠血管平滑肌细胞钟基因Per2表达的siRNA片段，使PER2mRNA表达量下调约84％。结论成功构建了大鼠PER2的RNAi慢病毒载体，为进一步研究时钟基因的功能奠定了基础。

目的探讨miR-182在非小细胞肺癌（NSCLC）发展中的作用及其相关机制。方法采用实时定量PCR检测NSCLC细胞系以及30组配对的NSCLC患者癌组织和癌旁组织样本中miR-182的表达水平。在NSCLC细胞株A549和H1299中过表达miR-182后,测定细胞增殖活性及侵袭转移能力。利用荧光素酶活性实验鉴定miR-182的预测靶基因（RECK）。采用qRT-PCR和Western blotting分别检测转染miR-182类似物和miR-182抑制物后RECK mRNA和蛋白的表达水平。结果miR-182在NSCLC细胞系和癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织,在伴淋巴结转移的肺癌患者癌组织中的表达水平明显高于不伴淋巴结转移者,差异有统计学意义（P〈0.01）。过表达miR-182可增强NSCLC细胞株A549和H1299的增殖、侵袭和迁移能力。双荧光素酶实验结果表明,RECK的翻译水平受miR-182直接调控。qRT-PCR和Western blotting 检测结果表明,转染miR-182类似物后,RECK表达水平降低,转染miR-182抑制物后,RECK表达水平升高。结论miR-182可调控RECK的表达,促进NSCLC的进展。

近年来大量研究表明microRNAs（miRNAs）与人类多种肿瘤的发生发展及侵袭转移存在着密切关系,miRNAs可能成为一类新的致癌基因或抑癌基因,它们通过抑制靶mRNA翻译或诱导靶mRNA降解在转录后水平调控基因表达,具有癌基因或抑癌基因的功能,参与肿瘤的发生、发展及侵袭转移。

背景与目的 nm23-H1基因是重要的肿瘤转移抑制基因。前期研究发现利用化学合成的小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）抑制nm23-H1基因的表达可明显增强肺癌细胞的侵袭力。为了进一步研究nm23-H1基因沉默后的分子生物学机制,本研究利用慢病毒介导的短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）建立nm23-H1基因稳定沉默的肺癌细胞株。方法将表达特异性抑制nm23-H1基因shRNA的慢病毒转染人大细胞肺癌细胞株NL9980和肺腺癌细胞株A549,通过嘌呤霉素筛选出稳定转染细胞株。逆转录PCR、定量PCR及Western blot法检测nm23-H1基因表达,并通过shRNA抵抗的nm23-H1基因重组质粒转染拯救实验验证,侵袭小室实验检测侵袭力改变。结果逆转录PCR、定量PCR和Western blot法检测稳定转染细胞株NL9980-99和A549-99中nm23-H1基因在mRNA和蛋白水平表达均明显降低;shRNA抵抗的nm23-H1基因重组质粒转染拯救实验重现nm23-H1的正常表达;侵袭小室实验显示NL9980-99和A549-99细胞侵袭力明显增强。结论成功建立nm23-H1基因稳定沉默的人大细胞肺癌细胞株NL9980-99和人肺腺癌细胞株A549-99,nm23-H1基因沉默后使NL9980-99和A549-99细胞的侵袭力明显增强。

角倍总RNA的提取是研究角倍蚜虫瘿形成分子机制的基础。本研究针对其多酚、多糖含量高的特点,从各类试剂盒及常规方法改良中优选出CTAB（异丙醇）沉淀方法,较为简单、经济、有效地提取角倍总RNA,其得率可达60.16μg·（100 mg）-1。利用该方法提取的RNA,通过RT-PCR克隆肌动蛋白基因ACTIN片段,碱基序列长度为934 bp,编码311个氨基酸,该序列与GenBank中已登录的ACTIN基因序列比对显示与芒果同源性最高,相似性达到95%,与其它肌动蛋白的氨基酸序列同源性达到86%以上。角倍总RNA的提取及看家基因ACTIN的克隆可为盐肤木和其他蚜虫虫瘿的分子克隆及基因表达分析奠定基础。

亨廷顿病是一种以运动、认知和精神障碍为主要表现的遗传性中枢神经系统变性疾病，其致病基因IT-5突变可引起胞嘧啶-腺嘌呤-鸟嘌呤（CAG）三核苷酸重复序列异常扩增，导致所编码的亨廷顿蛋自构象变化并产生神经毒性作用。亨廷顿病的基因治疗目前尚处于临床前阶段，主要包括基因沉默、诱导突变亨廷顿蛋白清除、导入神经营养因子基因，以及纠正突变型亨廷顿蛋白的毒性作用所致的基因转录、信号转导和线粒体代谢紊乱等。本文尝试对亨廷顿病的基因治疗研究进展简要叙述。

目的观察以短发卡RNA(shRNA)抑制鼻咽癌细胞survivin表达对细胞凋亡与增殖的影响。方法构建特异性survivin shRNA,转染CNE-2细胞。分组:A组为空白对照组;B组为阴性干扰组,转染pSIREN-survivin/nonsenseshRNA;C组为阳性干扰24h组,转染pSIREN-survivin/shRNA;D组为阳性干扰48h组,转染pSIREN-survivin/shRNA。以RT-PCR、Western-blot分别测定细胞survivin mRNA及蛋白,PI、TUNEL及MTT检测细胞周期、凋亡率、细胞增殖。结果转染效率约(70.90±4.76)%;C组survivin mRNA和蛋白抑制率分别为(41.58±0.63)%、(68.29±0.52)%;D组抑制率分别为(63.64±0.96)%、(70.83±0.48)%。C组凋亡率为(36.24±0.78)%,D组为(50.37±0.85)%,显著高于B组和A组;S期细胞减少,G2/M期比例增高;MTT结果提示细胞增殖受到明显抑制。结论特异性shRNA可有效干扰CNE-2内survivin的表达,诱导细胞凋亡并抑制其过度增...