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A fragment of 500 nt corresponding to 85% of the coat protein (CP) gene of 35 isolates of Apple chlorotic leaf spot virus (ACLSV) from different hosts and geographical areas was sequenced and the results were compared with those already available. Sequence alignments at the amino acid level showed that most of the variability was present in the N-terminal part of the CP cistron (overlapping with the movement protein), whereas the C-terminus was significantly less divergent. Four isolates (APR-EA5, PE 150, PE 154 and PE 297) differed in showing high variability throughout the CP gene. Phylogenetic analysis at the nucleotide and amino acid level clustered the isolates in two groups: A, containing the great majority of the isolates, and B, containing the above four diverging isolates. A few subclusters could be identified in group A: pome fruit isolates clustered together in two different groups, one being close to the two almond isolates and one subcluster containing all the Spanish isolates. One subgroup was composed of three similar sequences, each obtained from different hosts (peach, apricot, plum) originating from three different Countries, respectively (Italy, Lebanon and Jordan). In Western blot analysis, three different migration rates were found for the CPs of ten representative isolates. No correlation was observed between the electrophoretic mobility of CPs and the phylogenetic groups, indicating that other factors besides the primary structure must account for the different electrophoretic mobilities observed [Un frammento di 500 nt corrispondente all'85% del gene della proteina di rivestimento (CP) del Virus della maculatura clorotica fogliare del melo (ACLSV) proveniente da ospiti e aree geografiche diversi è stato sequenziato e i risultati sono stati confrontati con quelli già disponibili. Gli allineamenti della sequenza a livello degli aminoacidi hanno messo in evidenza che la maggior parte della variabilità era presente nella parte N-terminale del cistrone della CP (coincidente con la proteina di movimento), mentre la porzione C-terminale risultava significativamente meno divergente. Quattro isolati (APR-EA5, PE 150, PE 154 e PE 297) presentavano una variabilità elevata nell'ambito del gene della CP. L'analisi filogenetica a livello dei nucleotidi e degli aminoacidi ha evidenziato un raggruppamento degli isolati in due cluster: A, contenente la maggior parte di questi, e B, contenente i quattro isolati divergenti citati in precedenza. In A è stato possibile identificare alcuni sottogruppi: gli isolati delle pomacee erano riuniti in due gruppi diversi, uno affine ai due isolati del mandorlo e uno contenente tutti gli isolati spagnoli. Un sottogruppo era composto da tre sequenze simili, ognuna ottenuta da ospiti diversi (pesco, albicocco, susino), provenienti da tre Paesi, rispettivamente (Italia, Libano, Giordania). Nell'analisi Western blot, sono stati identificati 3 diversi tassi di migrazione per le CP di 10 isolati rappresentativi. Non è stata osservata alcuna correlazione fra la mobilità elettroforetica delle CP e i gruppi filogenetici, il che sta a indicare che devono essere presi in considerazione altri fattori, al di là della struttura primaria, per spiegare le diverse mobilità elettroforetiche osservate]

Phytoplasmas are wall-less prokaryotes associated with diseases in numerous plant species worldwide. In nature they are transmitted by phloem-sucking insects. Yellowing, decline, witches' broom, leaf curl, floral virescence and phyllody are the most conspicuous symptoms associated with phytoplasmas, although infections are sometimes asymptomatic. Since phytoplasmas cannot be cultured in vitro, molecular techniques are needed for their diagnosis and characterization. The titer of phytoplasma cells in the phloem of infected plants may vary according to the season and the plant species, and it is often very low in woody hosts. Different DNA extraction procedures have therefore been tried out to obtain phytoplasma DNA at a concentration and purity high enough for effective diagnosis. DNA/DNA hybridization methods were reported in the nineties to be appropriate for the detection of phytoplasmas, but at present PCR is considered the most suitable. Universal and group-specific primers have been designed on the rRNA operon of the phytoplasma genome and on plasmid sequences. RFLP analysis of the obtained amplicons has classified these pathogens into major 16Sr RNA groups. Group-specific primers have also been designed on other genomic sequences. PCR is a very sensitive technique, but due to the low titre of phytoplasmas a further increase in sensitivity may be required for accurate diagnosis. This is routinely obtained with a second round of PCR (nested PCR). The drawback of nested PCR is that there is a greater chance of obtaining false positives due to contamination. Many authors have therefore developed protocols based on hybridization (PCR/dot blot) or serological approaches (PCR/ELISA) to increase the sensitivity and specificity of the direct PCR, reducing the risks due to nested PCR. Real time PCR protocols may also improve the sensitivity and specificity of the direct PCR assay.

Eutypa lata and Phaeomoniella chlamydospora are important fungal grapevine trunk disease pathogens. Studies of their epidemiology and disease progression are hampered by the slow growth rates of the fungi and a lack of molecular tools. A protoplast-based transformation system was developed using hygromycin resistance as a positive selectable marker. The system was used to introduce a green fluorescent protein reporter gene that was expressed in the hyphae of both species. The reporter strains will be useful tools for further epidemiological studies. Furthermore, the transformation system will allow for genetic dissection of candidate pathogenicity or virulence genes by targeted replacement or disruption, in order to discern the rate of these genes in the disease process [Eutypa lata e Phaeomoniella chlamydospora sono funghi patogeni importanti agenti di malattie del tronco della vite. Gli studi sulla loro epidemiologia e sulla progressione della malattia sono ostacolati dalla lenta crescita di questi funghi e dalla mancanza di strumenti molecolari. E' stato sviluppato un sistema di trasformazione basato su protoplasti utilizzando la resistenza all'igromicina come marcatore positivo selezionabile. Il sistema è stato utilizzato per introdurre il gene reporter di una proteina fluorescente verde, che veniva espressa nelle ife di ambedue le specie. Questi ceppi reporter costituiranno strumenti utili per ulteriori studi di carattere epidemiologico. Inoltre, il sistema di trasformazione consentirà la discriminazione genetica della patogenicità candidata o dei geni della virulenza mediante sostituzione o rottura mirata, allo scopo di distinguere il livello di importanza di questi geni nel processo patologico.]

Bacterial pathogens often show great discrimination among potential host plants with regard to their abilities to cause disease. The basis of this race/cultivar specificity has been shown to reside in the matching of specific resistance (R) genes in the plant with determinants called avirulence (avr) genes in the pathogen: recognition in this way between host and pathogen enables the plant to react defensively to limit the invasion of the pathogen.

Fire blight, caused by Erwinia amylovora, is one of the important bacterial diseases of pear trees. It causes blight of different organs of the tree (blossoms, shoots, leaves, fruits and limbs) and production of exudates. During a survey of pear orchards in different areas of the Iranian province of Guilan (Astaneh, Ashrafieh, Lahijan and Kiashahr), necrotic shoots and exudates were observed in apple and pear trees. Samples taken from infected tissues were crushed in peptone water and aliquots of 100 micronl of the extract were cultured on nutrient agar (NA) and LB containing cycloheximide (50 microng mlE-1). A rod-shaped, gram negative, facultative anaerobic bacterium was consistently isolated, which produced levan in sucrose media, but not fluorescent pigment in King's B medium. All isolates induced hypersensitive reaction (HR) in tobacco and geranium leaves, were oxidase-, nitrate-, urease-, and indole-negative, could not rot potato tuber slices, produced H2S and grew at 36 deg C. The isolates could utilize citrate, arabinose, sorbitol, galactose and trehalose as carbon source and their gelatin test was positive. Based on morphological, biochemical and physiological characters and PCR amplification with specific primers, most bacterial isolates were identified as E. amylovora. Some isolates from spear orchards were identified as Pseudomonas syringae pv. syringae. This is the first report of the occurrence of E. amylovora on pear trees in the province of Guilan [Il colpo di fuoco, causato da Erwinia amylovora, è una delle malattie batteriche più importanti del pero. Essa determina avvizzimenti, imbrunimenti e necrosi di organi diversi della pianta (boccioli, germogli, foglie frutti e rami) e la produzione di essudati. Nel corso di un'indagine sugli impianti di pero in aree diverse della provincia iraniana di Guilan (Astaneh, Ashrafieh, Lahijan e Kiashahr), sono stati osservati germogli necrotici ed essudati su piante di pero e di melo. Campioni prelevati da tessuti infetti sono stati omogeneizzati in acqua peptonata e aliquote di 100 micronl dell'estratto sono state coltivate su agar nutritivo (NA) e su LB contenenti cicloesimide (50 microng mlE-1). E' stato costantemente isolato un bacillo Gram negativo, anaerobico facoltativo, che produceva levano in substrati con glucosio, ma non pigmento fluorescente in substrato B di King. Tutti gli isolati inducevano una reazione di ipersensibilità (HR) nelle foglie di tabacco e geranio, erano ossidasi-, nitrato-, ureasi- e indolo-negativi, non determinavano marciumi su sezioni di tubero di patata, producevano H2S e crescevano a 36 gradi C. Gli isolati potevano utilizzare citrato, arabinosio, sorbitolo, galattosio e trealosio come fonte di carbonio e il loro test alla gelatina era positivo. In base ai caratteri morfologici, biochimici e fisiologici e all'amplificazione PCR con primer specifici, la maggior parte degli isolati è stata identificata come E. amylovora. Alcuni isolati provenienti da pereti sono stati identificati come Pseudomonas syringae pv. syringae. Questa è la prima segnalazione della presenza di E. amylovora su piante di pero nella provincia di Guilan.]

In a study on grapevines in Jordan conducted between 2002 and 2003, Grapevine virus A (GVA) was detected in all areas where grapevines were planted. DAS-ELISA analysis of samples from symptomatic trees showed that 16.1% of samples were infected with GVA. Using a GVA-specific primer pair (H587/C995), a portion of the coat protein gene of the virus was amplified by IC-RT-PCR and RT-PCR, using leaf extracts and RNA extracted from infected grapevines, respectively. After cloning and sequencing the coat protein gene of the Jordanian isolate of GVA (GVA-Jo), the sequence of the amplified product was compared with sequences of other GVA isolates from different Countries [In uno studio sulla vite in Giordania, condotto fra il 2002 e il 2003, il Virus A (GVA) della vite è stato diagnosticato in tutte le aree di coltivazione di questa specie. L´analisi DAS-ELISA di campioni derivanti da piante sintomatiche ha dimostrato che il 16,1% degli stessi erano infetti da GVA. Utilizzando un paio di primer specifici per GVA (H587/C995), è stata amplificata una porzione del gene della proteina di rivestimento del virus mediante IC-RT-PCR ed RT-PCR, utilizzando, rispettivamente, estratti di foglie ed RNA estratto da piante infette. Dopo la clonazione e il sequenziamento del gene della proteina di rivestimento dell´isolato giordano di GVA (GVA-Jo), la sequenza del prodotto amplificato è stata confrontata con le sequenze di altri isolati di GVA provenienti da Paesi diversi.]

Four races of Xanthomonas campestris pv. malvacearum (Xcm), viz races 23, 27 and 32 (isolated from Gossypium hirsutum) and race 23b (from Gossypium barbadense) were studied. The plasmid profile of the natural isolates showed four plasmids in races 23 and 23b (ca. 60, 40, 23, 8.2 kb), five in race 27 (ca. 60, 40, 23, 8.2 and 3.7 kb) and six in race 32 (ca. 60, 40, 23, 8.2, 3.7 and 1.6 kb). Continuously sub-cultured laboratory isolates of the Xcm races resulted in the loss of all but two plasmids, ca. 60 and 40 kb in size. When the laboratory isolates were passed through cotton (Gossypium hirsutum), they regained certain plasmids so that four plasmids were found in race 23 and 23b (ca. 60, 40, 23 and 8.2 kb), five in race 27 (ca. 60, 40, 23, 8.2 and 3.7 kb) and six in race 32 (ca. 60, 40, 23, 8.2, 3.7 and 1.6 kb), which was more or less similar to the original isolates. The isolates recovered from cotton maintained their plasmid profile (except for minor changes in the miniplasmids) after storage for six months at _70 deg C in 50% glycerol. It is suggested that plasmid profiles among highly virulent races of Xcm are unstable during repeated sub-culturing at room temperature, resulting in rapid loss of some plasmids. However, when the cultures were sub-cultured and stored at _70 deg C, the plasmid profile was fairly stable except for the miniplasmids (ca. 3.7 and 1.6 kb) [Sono state studiate quattro razze di Xanthomonas campestris pv. malvacearum (Xcm), cioè le razze 23, 27 e 32 (isolate da Gossypium hirsutum) e la razza 23b (isolata da Gossypium barbadense). Il profilo dei plasmidi degli isolati naturali ne evidenziava quattro nelle razze 23 e 23b (ca. 60, 40, 23, 8,2 kb), cinque nella 27 (ca. 60, 40, 23, 8,2 e 3,7 kb) e sei nella razza 32 (ca. 60, 40, 23, 8,2, 3,7 e 1,6 kb). Gli isolati delle razze di Xcm sub-coltivati continuamente in laboratorio andavano incontro alla perdita di tutti i plasmidi salvo due, di ca. 60 e 40 kb. Quando venivano passati attraverso il cotone (Gossypium hirsutum), gli isolati di laboratorio riacquistavano certi plasmidi, per cui nelle razze 23 e 23b sono stati ritrovati quattro plasmidi (ca. 60, 40, 23 e 8,2 kb), cinque nella razza 27 (ca. 60, 40, 23, 8,2 e 3,7 kb) e sei nella razza 32 (ca. 60, 40, 23, 8,2, 3,7 e 1,6 kb), che risultava più o meno simile agli isolati originali. Gli isolati recuperati dal cotone mantenevano il loro profilo plasmidico (eccetto che per cambiamenti secondari a carico dei miniplasmidi) dopo una conservazione per sei mesi a _70 gradi C in glicerolo al 50%. I risultati fanno ritenere che i profili plasmidici delle razze virulente di Xcm siano instabili nel corso della sub-coltura a temperatura ambiente e vadano incontro a una perdita rapida di alcuni plasmidi. Tuttavia, quando si effettuava la sub-coltura e la conservazione a _70 gradi C, il profilo plasmidico risultava sostanzialmente stabile, eccetto che per i miniplasmidi (ca. 3,7 e 1,6 kb)]

Tomato spotted wilt virus (TSWV) is a serious threat to both horticultural and ornamental crops. Three fresh-market tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) lines were transformed with the nucleoprotein gene of TSWV by Agrobacterium tumefaciens. Primary transformants for each line were analysed for transgene integration and expression. Results showed that inserted transgenic DNA was often rearranged. Progenies of selected primary transformants were obtained by self-pollination and tested for resistance to TSWV. A completely resistant line was identified having a single integration locus with multiple rearranged transgene copies and a true-to-type phenotype. It will be further tested for possible inclusion in breeding programs [Il virus dell'avvizzimento a chiazze del pomodoro (TSWV) e' una seria minaccia alle colture, sia ortive, sia ornamentali. Tre linee di pomodoro (Lycopersicon esculentum Mill.) per il consumo fresco sono state trasformate con il gene della nucleoproteina del TSWV mediante Agrobacterium tumefaciens. I trasformanti primari per ogni linea sono stati analizzati riguardo all'integrazione e all'espressione del transgene. I risultati hanno dimostrato che il DNA transgenico inserito era spesso riarrangiato. Mediante autoimpollinazione sono state ottenute progenie di trasformanti primari selezionati, sulle quali e' stata verificata la resistenza a TSWV. E' stata identificata una linea completamente resistente che presentava un singolo locus di integrazione con copie multiple riarrangiate del transgene e un fenotipo uguale al tipo. Esso verra' ulteriormente sperimentato in funzione di un possibile inserimento in programmi di miglioramento genetico]

During a serious epidemic of crown and cane gall on the blackberry-raspberry (Rubus occidentalis-Rubus idaeus) hybrid Lochness in a specialized crop in the province of Treviso (Northern Italy), Gram-negative bacteria were found associated with tumours. Following experimental inoculation, these bacteria caused tumours on tomato stems and on pot-grown hybrid canes in greenhouse. These bacteria were found to possess a Ti plasmid, common to Agrobacterium. The resulting fatty acid profile did not correspond to any known Agrobacterium species, but did indicate an affinity with the genus Agrobacterium. Partial 16S rRNA sequencing revealed that the bacteria were closely related to three strains of Agrobacterium rhizogenes, in particular with a strain isolated from a peach tumour [Nel corso di una grave epidemia di cancro del fusto e del colletto dell'ibrido rovo-lampone (Rubus occidentalis-Rubus idaeus) Lochness, riscontrata in una coltura specializzata in provincia di Treviso (Italia Settentrionale), sono stati rinvenuti batteri Gram-negativi associati ai tumori. A seguito dell'inoculazione sperimentale, questi batteri causavano tumori sui fusti di pomodoro e sui fusti dell'ibrido coltivati in vaso, in serra. Si è accertato che questi batteri possedevano un plasmidio Ti, comune ad Agrobacterium. Il profilo degli acidi grassi risultante non corrispondeva ad alcuna specie conosciuta di Agrobacterium, ma testimoniava l'esistenza di un'affinità con il genere Agrobacterium. Il sequenziamento parziale dell'rRNA 16S ha evidenziato che i batteri erano in relazione stretta con tre ceppi di Agrobacterium rhizogenes, in particolare con un ceppo isolato da un tumore del pesco]

Phomopsis viticola (Sacc.) Sacc. is the phytopathogenic fungus causing a severe disease of grapevine known as Phomopsis cane and leaf spot. Protoplasts from mycelium of P. viticola were successfully transformed with plasmids carrying either the bacterial hph gene, conferring resistance to hygromycin B (pAN7-1, pOHT, pOHT-AMA1), or the Bml sup (r) gene from Neurospora crassa, causing resistance to benzimidazole fungicides (pBT6). Up to more than 300 transformants per microng of plasmid DNA were obtained with the hph marker gene. The highest effectiveness was obtained with pOHT, whereas pBT6 yielded around 25 transformants per microng of plasmid DNA. Southern blot analysis showed the occurrence of multiple integration events in the fungal genome of all tested plasmids. Experiments of co-transformation with pOHT and pBT6 were successful and about 70% of transformants were resistant to both hygromycin B and benomyl. The Instant Gene Bank technique and mutagenesis through Restriction Enzyme Mediated Integration (REMI) were attempted. As reported for other phytopathogenic fungi, the REMI technique proved to be a powerful method for obtaining mutant strains with variation in phenotypic traits [Phomopsis viticola (Sacc.) Sacc. e' il fungo fitopatogeno agente di una malattia grave della vite denominata escoriosi. Protoplasmi derivanti dal micelio di P. viticola sono stati trasformati con plasmidi portanti sia il gene batterico hph, che conferisce la resistenza all'igromicina B (pAN7-1, pOHT, pOHT-AMA1), sia il gene Bml sup (r) di Neurospora crassa, che causa la resistenza ai fungicidi benzimidazolici (pBT6). Con il gene marcatore hph sono stati ottenuti fino a piu' di 300 trasformanti per microng di DNA plasmidiale. La maggiore efficienza e' stata ottenuta con pOHT, mentre pBT6 produceva circa 25 trasformanti per microng di DNA plasmidiale. L'analisi Southern blot ha evidenziato il verificarsi di eventi di integrazione multipla di tutti i plasmidi sperimentati nel genoma del fungo. Esperimenti di co-trasformazione con pOHT e pBT6 hanno avuto successo e circa il 70% dei trasformanti e' risultato resistente sia all'igromicina B, sia al benomyl. Sono state provate la tecnica dell'Instant Gene Bank e la mutagenesi attraverso l'integrazione mediata da enzimi di restrizione (REMI). Come riportato per altri funghi fitopatogeni, la tecnica REMI si e' dimostrata un metodo efficace per ottenere ceppi mutanti con variazione dei caratteri fenotipici]