Dissertation

Konvergente Synthesemethoden für N- und O-glycosylierte Proteine

Rädisch, Marisa

2016

Overview

Durch die konvergente Glycopeptidsynthese ist es möglich, Bibliotheken von Glycopeptiden zu synthetisieren, Anhand solcher Glycopeptidbibliotheken können Struktur- Wirkungsbeziehungen untersucht werden. Das HIV-1 Oberflächenprotein gp120 ist stark glycosyliert und wird selektiv von breitneutralisierenden, monoklonalen Antikörpern (z. B. PG9) erkannt. Es wurde in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Robinson ein glycosyliertes HIV-1 B/C Loop Mimetikum von Phe-159 bis Ala-172 des CAP45-Strangs synthetisiert. Um den β-Turn in 12 zu stabilisieren, wurde das Templat D-Pro/ L-Pro verwendet. Ein Pseudoprolindipeptid wurde vor die Glycosylierungsstelle Asn-160 eingebaut, um die Aspartimidbildung bei der Synthese zu reduzieren. Das Peptid 7 (1.8 mM) wurde mit HATU/HOAt zyklisiert, anschließend desallyliert und neben GlcNAc-NH2 11 wurde auch Man5GlcNAc2-NH2 14 gekuppelt. Beide Mimetika 12 und 15 wurden jedoch nicht vom Antikörper PG9 erkannt, da das Peptidrückgrad keinen stabilen β-Hairpin aufwies. Daraufhin wurde Alanin-172 durch Valin ersetzt, außerdem wurden Arginin-166 und Leucin-165 entfernt. Dies führte zum optimierten Glycopeptid 19, das vom Antikörper PG9 erkannt wurde. Zur Darstellung von Biokonjugaten durch Click-Kupplung wurde ein Glycopeptid aufgebaut. Das Biotin-Konjugat 25 wurde durch CuI- katalysierte Addition des Alkins 23 an das Azid 22 erhalten. Das V1/V2 Mimetikum könnte an einem geeigneten Carrier auf diese Weise immobilisiert werden. In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Lichtenstein wurde die Synthese von einheitlich glycosylierten IgG 1 Fc-Fragmenten verfolgt. Es wird vermutet, dass der Abbau von Motorneuronen bei ALS Patienten mit der Struktur der NGlycane des Fc-Teils von ALS spezifischen Antikörpern zusammenhängt. Es soll die Wechselwirkung von unterschiedlich glycosylierten Fc-Fragmenten mit Fc-Rezeptoren untersucht werden. Die Peptidthioester IgG1 Fc 223-260 36 und IgG1 Fc 261-286 43 wurden durch SPPS, das Glycopeptidhydrazid IgG1 Fc 287-320 50 durch konvergente Glycopeptidsynthese synthetisiert. Außerdem wurde Fc 287-320 53 mit bisected N-Glycan dargestellt. Das Glycopeptid IgG1 Fc 261-286 59 war durch Entschützung des Glycopeptids 50 und anschließender nativer chemischer Ligation mit dem Thioester 43 zugänglich. Durch metallfreie Entschwefelung wurde aus Cys-287 das native Alanin erhalten. Während der Entschwefelung war das native Cys-261 mit einer PhAcm-Gruppe geschützt. Die PhAcm-Gruppe wurde anschließend enzymatisch durch Penicillin G Acylase in 2 M GdmCl entfernt. Die Thiolyse des Hydrazids 73 und anschließende Ligation mit dem Cystein-Fragment 75 gelang jedoch aufgrund der ε–Caprolactambildung des C-terminalen Lysins des Thioesters 74 nicht. Die Untersuchung von Proteoglycanen ist von Bedeutung, da veränderte Glycosaminoglycane negative Folgen für die menschliche Gesundheit haben können. Es wurde die Semisynthese des Modellproteoglycans Bikunin untersucht. Bikunin wurde in drei Peptide unterteilt. Das OGlycopeptid Bikunin 1-25 88 und das N-Glycopeptid Bikunin 26-50 108 wurden als Thioester bzw. als Hydrazid synthetisiert. Die Kupplungsbedingungen von der racemisierungsanfälligen O-Glycosylaminosäure 82 wurden optimiert. Das NGlycopeptid wurde konvergent unter Verwendung des Glycosylamins 48 erhalten. Das Cysteinfragment Bikunin 51-147 120 mit N-terminalem His6-SUMO Tag wurde durch rekombinante Expression aus E. coli hergestellt und durch enzymatische Spaltung des His6- SUMO Tags freigesetzt. Die Verknüpfung des Thioesters 88 mit dem N-Glycopeptid 108 ergab Bikunin 1-50 111. Das N- und O-glycosylierte Bikunin 1-147 121 konnte nach Umwandlung des Hydrazids 111 zum Thioester und nativer chemischer Ligation mit Bikunin 51-147 120 erhalten werden. Nach oxidativer Rückfaltung wurde Bikunin 121a erhalten, das inhibitorische Aktivität gegenüber Trypsin zeigte.

• Publisher: ProQuest Dissertations & Theses
• Subject: Biochemistry / Bioengineering / Bioinformatics
• ISBN: 9781687909657, 1687909652