Dissertation

Identification des domaines de Cdx2/3 impliqués dans la régulation de son activité transcriptionnelle par la phosphorylation

Cartier, Andreane

2008

Overview

Au cours du développement embryonnaire, les gènes Cdx régulent l'expression de gènes Hox, impliqués dans la formation de l'axe antéro-postérieur. Le facteur de transcription Cdx2/3 est impliqué dans l'arrêt de la prolifération cellulaire et l'induction de la différenciation entérocytaire, entre autres par le contrôle de l'expression d'enzymes digestifs et de protéines de jonctions cellulaires. Son expression est retrouvée au niveau des entérocytes de la villosité du petit intestin ainsi qu'au niveau de l'épithélium du colon proximal. Sa surexpression dans une lignée cellulaire épithéliale intestinale de crypte de rat (IEC-6) induit un début de différenciation cellulaire. Cdx2/3 possède également un rôle de suppresseur de tumeur, puisque son expression inhabituelle est souvent retrouvée dans certains cancers. L'activité transcriptionnelle et la stabilité de Cdx2/3 peuvent être régulées par différentes kinases. Nous avons préalablement démontré que la MAPkinase p38α régule positivement l'activité transcriptionnelle de Cdx2/3 dans les cellules différenciées, que le domaine d'interaction de cette kinase avec Cdx2/3 se situe aux acides aminés 61 à 76 et que la sérine 156 serait une cible de la MAPkinase p38α. Le but de mon projet était d'identifier d'autres domaines candidats à la régulation de Cdx2/3 par la MAPkinase p38α, mais aussi par la MAPkinase ERK1/2. Pour ce faire, plusieurs mutants de sites putatifs, seuls ou combinés, pour la phosphorylation par les MAPKs ont été générés par mutagénèse dirigée. Des essais de phosphorylation in vitro sur ces mutants on été réalisés afin d'étudier leur impact sur la phosphorylation de la protéine. Afin de vérifier si d'autres sites pouvaient être impliqués dans l'interaction de Cdx2/3 avec les MAPKs, des essais de précipitation GST de mutants de délétion de la portion N-terminale Cdx2/3 ont été effectués. L'expression stable dans la lignée IEC-6 des différents mutants a par la suite été effectuée afin d'observer les phénotypes provoqués par ces mutations, notamment la régulation de plusieurs autres cibles, observée par RT-PCR. Nos résultats démontrent que les sérines 33, 60, 99 et 156, de même que le motif 4 sérines situé en C-terminal de la protéine sont des sites de phosphorylation par les MAP kinases p38α et ERK1/2. Nous montrons aussi que les acides aminés 61 à 76 de Cdx2/3 sont nécessaires à l'interaction avec la MAPK p38α, alors que ERK1/2 se lie aux acides aminés 37 à 44 in vitro. Grâce aux populations stables IEC-6-Cdx2/3 sauvage ou mutants, nous avons démontré que certaines mutations affectent le patron de bandes observé en immunobuvardage, le taux de prolifération des cellules, la densité de saturation, le phénotype des cellules à 30 jours post-confluence et l'expression de gènes cibles dans les cellules IEC-6. Ces résultats montrent que la phosphorylation par les MAPKs représenterait un mécanisme de régulation important de l'activité transcriptionnelle de Cdx2/3 et pourrait moduler ses fonctions reliées à la prolifération et à la différenciation des cellules intestinales épithéliales.

• Publisher: ProQuest Dissertations & Theses
• Subject: Cellular biology / Molecular biology
• ISBN: 9780494494745, 0494494743