Dissertation

Pixelenkénti autofluoreszcencia korrigált FRET mérés és implementálása pannoramic confocal konfokális patológiai szkennerre

Rebenku, István

2024

Overview

A digitális patológia gyors fejlődése lehetővé teszi szöveti szintű morfológiai felvételek készítését. Immunhisztokémiai jelölések alkalmazásával ezek a morfológiai jegyek egy vagy két molekula expressziós szintjével korreláltathatóak. Napjainkban a fluoreszcenciás patológiai szkennerek megjelenése és elterjedése zajlik, melyek lehetővé teszik több molekula azonos mintában történő, multiplex jelölésen alapúló vizsgálatát. A Pannoramic Confocal az első digitális patológiai szkenner, amely a hagyományos transzmissziós és fluoreszcenciás képalkotáson túl konfokalitást is biztosít. A szkennert a konfokális képalkotás, stabilitás, pontosság, linearitás és érzékenység szempontjából vizsgáltuk. A konfokális kép pontkiterjedési függvényét aszimmetrikusnak, de térben invariánsnak mértük; ennek alapján dekonvolúciós algoritmust implementáltunk a műszerhez. Az X-Y dimenzióban mért stabilitás és relokalizációs pontatlanság jóval a felbontási határ alatt volt. Az intenzitásválasz lineáris volt (R² ≥0,9996). A kalibrált mérések azt mutatták, hogy indirekt jelölés alkalmazásával sejtenként ≥ 2000 molekula jól detektálható és leképezhető. A megvilágítást vizsgálva azt találtuk, hogy a mikroszkóp megvilágítása aszimmetrikus és inhomogén. Ennek kiküszöbölésére bevezettünk egy korrekciós módszert, amely alkalmas kisebb területről és térben változatos mintákról készült felvételek megfelelő korrekciójára is, valamint megbízható kvantitatív eredményeket ad. Ennek alkalmazásával, ill. a mérési pontosság ismeretében a Pannoramic Confocal alkalmas lehet szövettani metszeteken molekuláris interakciók mérésére. A Förster rezonancia energiatranszfer (FRET) népszerű eszköz a molekuláris kölcsönhatások tanulmányozására, mivel a 1-10 nm-es tartományban igen érzékeny a távolságra. Az intenzitás alapú, spektrálisan korrigált FRET mérési módszer előnye, hogy háromdimenziós, valamint időfüggő mérésekre is alkalmas. Annak érdekében, hogy használható legyen magas autofluoreszcenciájú metszetek mikroszkópos mérése során pixelenkénti autofluoreszcencia korrekcióval, az áramlási citometriában használt sejtenkénti korrekciós algoritmust adaptáltuk. A kidolgozott pixelenkénti autofluoreszcencia korrekció javítja a mérések pontosságát és különösen alacsony szignál/autofluoreszcencia értékek, valamint térben változatos autofluoreszcenciájú minták esetében ajánlható. Az analízis elvégzésére írt Fiji/ImageJ plugin szabadon elérhető.A mérési eljárást a Pannoramic Confocal készülékkel is teszteltük, ahol a sejteken és fagyasztva metszett szöveten mért FRET hatásfokok a kontrollként használt LSM 880 lézerpásztázó mikroszkóppal mértekkel egyezést mutattak. Ez alapján a pixelenkénti autofluoreszcencia korrigált FRET mérés implementálásra került a Pannoramic Confocal digitális patológiai szkenner szoftverében, megteremtve a diagnosztikai célú FRET mérések metodológiai és instrumentális alapját.

• Publisher: ProQuest Dissertations & Theses
• Subject: Biomedical engineering / Medical imaging
• ISBN: 9798346317227