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目的建立一种动态检测泛素一蛋白酶系统（UPS）活性的新方法，并利用此方法观察尼古丁对鱼藤酮诱导的UPS功能障碍的影响。方法合成UPS降解信号CLl，将其与含有绿色荧光蛋白的质粒pEGFP—C1连接，构建CL1-pEGFPC1质粒并转染PCI2细胞，经G418筛选后得到稳定表达的CL1-pEGFPC1细胞系。蛋白酶抑制剂MGl32、鱼藤酮或尼古丁＋鱼藤酮处理细胞，应用免疫印迹技术检测细胞内GFP含量的变化，荧光显微镜观察细胞荧光强度的变化。结果稳定转染的CLl-pEGFP—C1细胞无绿色荧光，而MGl32处理后细胞内绿色荧光显著增加，且随MGl32浓度增加荧光强度逐渐增加，GFP表达逐渐增高（P〈0．05）。鱼藤酮处理后细胞内绿色荧光显著增加，GFP含量明显高于非处理组（P〈O．05）。低浓度尼古丁处理组细胞内荧光强度显著降低，GFP蛋白表达显著减少，高浓度尼古丁处理组细胞内荧光强度降低更加显著，GFP蛋白表达减少更明显（P〈o．05）。结论成功建立了能够在活细胞中全面、动态检测UPS活性的方法。鱼藤酮可降低UPS活性，尼古丁可减轻鱼藤酮引起的UPS功能障碍。

目的探讨FAT10的碳末端双甘酸缺失突变体对宫颈癌He La细胞增殖和凋亡的影响。方法收集宫颈原位癌组织标本和正常宫颈组织标本各5例,Western blotting法检测组织中FAT10蛋白的表达。采用定点突变技术构建pc DNA3.0-flag-FAT10？GG质粒,分别将野生型FAT10、FAT10△GG及空载体（阴性对照）瞬时转染至He La细胞中,以野生型Hela细胞作为空白对照组,采用Western blotting法检测转染效率,CCK-8法检测细胞增殖情况。转染24h后,各组细胞经顺铂诱导凋亡,采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果 FAT10蛋白在宫颈癌组织中的表达明显高于正常组织。过表达野生型FAT10对宫颈癌细胞的增殖有明显促进作用,但FAT10发生双甘酸突变之后,该作用受到明显抑制。流式细胞仪检测结果显示：与空白对照组（22.7%±4.2%）和阴性对照组（24.1%±3.8%）相比,过表达野生型FAT10组的细胞凋亡率（10.9%±2.0%）明显降低（P〈0.05）,而FAT10？GG组的细胞凋亡率（25.7%±5.1%）无明显变化（P〉0.05）。结论FAT10可通过其碳末端双甘酸结构促进肿瘤细胞增殖,减少凋亡,从而促进肿瘤的发生发展。

泛素结合酶（E2）是泛素／26S蛋白酶体途径中3个关键酶之一，在靶蛋白识别、与泛素连接酶（E3）互作等蛋白的泛素依赖性水解和N-末端规则依赖性水解途径的关键环节中起重要作用。采用Sdexa测序技术获得了1条普通油茶E2的全长cDNA序列，命名为UBE2一J2，该基因编码239AA，与其它物种的E2具有较高的一致性和相似性；同源建模的结果表明：普通油茶UBE2-J2蛋白具有泛素结合酶催化位点（UBCc），第8～122位氨基酸碱基为其泛素结合酶基因家族的保守区域，第75～122位氨基酸残基区域中有17个可与泛素形成硫酯键中间产物的残基，其中，87位的半胱氨酸残基是该酶活性中心位点，另有5个残基是与E3酶相互作用的位点。UBE2．J2具有C端延伸结构，故普通油茶UBE2-J2蛋白属于II类E2基因家族成员。

目的：探讨人不同病理级别脑胶质瘤组织中 RWD 结构修饰增强子（RWD containing sumoylation enhancer, RSUME）、泛素样小分子修饰因子（small ubiquitin-like modifier,SUMO）-1、缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α）、血管内皮生长因子（VEGF）的表达及其相关性。方法应用 RT-PCR 法检测63例不同级别人脑胶质瘤组织及9例正常脑组织中 RSUME mRNA、HIF-1αmRNA、VEGF mRNA 的表达,免疫组化检测组织中 SUMO-1、HIF-1α、VEGF 表达情况,分析与胶质瘤分级的关系以及表达的相关性。结果脑胶质瘤组织中 RSUME、HIF-1α、VEGF mRNA 较正常脑组织中表达明显增高（P 〈0.01）,并随胶质瘤恶性程度的增高而表达增高（P 〈0.01）,RSUME 与HIF-1α、VEGF 的 mRNA 表达水平呈正相关；脑胶质瘤组织中 SUMO-1、HIF-1α、VEGF 的蛋白表达较正常脑组织明显增高（P 〈0.01）,并随胶质瘤恶性程度的增高而表达增高（P 〈0.01）,SUMO-1与 HIF-1α蛋白表达呈正相关（r =0.857,P 〈0.01）；Kaplan-Meier 生存分析及 Log-rank 检验显示低表达 RSUME 患者的 PFS 明显长于高表达组（χ2=36.032,P 〈0.01）。结论RSUME 可能通过 SUMO 化增强 HIF-1α/VEGF 通路表达,预示 RSUME 可能与脑胶质瘤血管新生及肿瘤的侵袭、进展有关,预示 RSUME 可作为胶质瘤治疗的新靶点。

目的观察多器官功能障碍综合征（MODS）小鼠脾脏树突细胞（DCs）中MARCH1和MHC-Ⅱ类分子的蛋白及mRNA表达情况,探讨MARCH1对MHC-Ⅱ类分子的泛素化调控作用。方法 110只C57BL/6小鼠随机分为1、3、5、7、10d组和正常对照组,前5个实验组小鼠采用腹腔注射酵母多糖法复制MODS模型（每组20只）,正常对照组（10只）不做特殊处理。使用磁珠和Mini MACS分选磁场分离出小鼠脾脏DCs,分别采用Western blotting和Real Time PCR检测脾脏DCs中MARCH1和MHC-Ⅱ类分子的蛋白及mRNA表达情况,并观察其变化规律与病程的关系。结果脾脏DCs中MHC-Ⅱ类分子蛋白的表达在MODS 1d时即明显升高并达到峰值（P〈0.05）,而后逐渐下降,至10d时达到最低（P〈0.05）。MHC-Ⅱ类分子mRNA的表达在整个病程中无明显变化（P〉0.05）。MARCH1蛋白表达在MODS 1d时即显著降低（P〈0.05）,后开始回升,至7d时达到较高水平,而在10d时又再次下降,但与正常对照组相比,均无统计学差异。MARCH1 mRNA表达的变化与蛋白表达变化规律一致。结论在MODS病程中,MHC-Ⅱ类分子和MARCH1蛋白表达变化的趋势相反,MARCH1可能通过泛素化MHC-Ⅱ类分子来调控其表达水平,进而调控DCs的成熟状态及启动免疫应答反应。

目的研究泛素羧基末端水解酶L1（VCH-L1）蛋白在糖尿病肾病（DN）模型中的表达变化。方法原代培养大鼠肾小球系膜细胞，分别给予30mmol／L葡萄糖（高糖组）、5．4mmol／L葡萄糖（正常对照组），在0、8、16、72h采用MTT法动态观察两组细胞增殖情况，Westernboltting检测UCH-L1蛋白表达情况。采用自发性2型DN模型OLETF大鼠，每4周一次动态监测血糖及24h尿蛋白定量，于36周时处死大鼠，观察肾组织病理改变并采用Western boltting分析肾皮质中UCH-L1的表达。结果高糖环境能抑制大鼠肾小球系膜细胞的增殖。与正常对照组相比，高糖组系膜细胞UCH-L1蛋白表达在8、72h时点明显降低，16h时点明显增高，差异有统计学意义（P〈0．011。与对照LETO大鼠相比，OLETF大鼠血糖、24h尿蛋白定量均逐渐增高，36周时肾脏发生了DN的早期病理改变，且肾皮质中UCH-L1蛋白表达降低（P〈0．01）。结论UCH-L1蛋白表达在DN模型中以降低为主。蛋白降解途径失调可能在DN的发生、发展起到一定作用。

近期研究发现树突细胞（DCs）表面MHC-Ⅱ类分子的含量是通过MHC-Ⅱ类分子β链的泛素化水平来调控的[1],而MARCH1,一种E3泛素连接酶,在这一过程中起关键性的作用。但目前MARCH1在体内如何调控MHC-Ⅱ类分子的表达尚不清楚。研究表明,

背景与目的泛素羧基末端水解酶-1（ubiquitin C terminal hydrolase-L1,UCH-L1）是近期研究较多的一类癌基因,在多种恶性肿瘤如食管癌、肺癌、乳腺癌等中均有异常表达和活性增强。本研究旨在探讨脂质体转染UCH-L1siRNA对人肺腺癌H157细胞增殖、凋亡的影响。方法人工合成抑制UCH-L1基因的siRNA片段,通过脂质体转染到H157细胞内,显微镜下观察其形态学变化;流式细胞术检测各组细胞周期变化和凋亡指数;RT-PCR检测UCH-L1mRNA的表达;Western blot检测UCH-L1蛋白表达。结果转染siRNA后的H157细胞,细胞增殖受到显著抑制,细胞出现明显凋亡,UCH-L1mRNA表达显著下降,UCH-L1蛋白水平显著下降。结论应用RNA干扰靶向抑制UCH-L1基因可以显著抑制H157细胞增殖,促进调亡。UCH-L1可能成为肺癌基因治疗的一个新靶点。

目的 克隆表达亚洲牛带绦虫泛素缀合酶E2（UBCE2）全长编码序列，获得纯化的重组蛋白，为进一步功能研究做充分准备。方法以亚洲牛带绦虫成虫cDNA文库中含有UBCE2基因的质粒作为模板，扩增该基因，将其克隆到原核表达载体pET-28a（＋）中，测序鉴定重组质粒，在大肠杆菌BL-21／DE3中用IPTG诱导，表达产物通过十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定，重组后的蛋白用His-镍蛋白纯化柱纯化，并使用Western blotting分析其免疫反应性。结果PCR、双酶切及DNA测序结果均表明重组质粒pET-28a（＋）-UBCE2构建成功，该基因在大肠杆菌中以包涵体形式得到表达，十二烷基肌氨酸钠纯化后蛋白通过SDS-PAGE鉴定结果表明该基因在大肠杆菌BL-21／DE3得到高效表达，亲和层析得到高纯度的蛋白且该重组蛋白可被亚洲带绦虫及牛带绦虫患者血清识别，表明其有免疫反应性。培论亚洲牛带绦虫UBCE2可在原核表达系统中表达，并具有免疫反应性，为进一步研究该基因的功能奠定基础。

Ubiquitination has emerged as a crucial mechanism that regulates signal transduction in diverse biological pro- cesses, including different aspects of immune functions. Ubiquitination regulates pattern-recognition receptor sig- naling that mediates both innate immune responses and dendritic cell maturation required for initiation of adaptive immune responses. Ubiquitination also regulates the development, activation, and differentiation of T cells, thereby maintaining efficient adaptive immune responses to pathogens and immunological tolerance to self-tissues. Like phosphorylation, ubiquitination is a reversible reaction tightly controlled by the opposing actions of ubiquitin ligases and deubiquitinases. Deregulated ubiquitination events are associated with immunological disorders, including auto- immune and inflammatory diseases.