Dissertation

Dendritische Zellen, ADAM17 und Neprilysin in ihrer Rolle bei Keloiden

Rath, Mathias

2023

Overview

1.1 Hintergrund und ZieleDie Ausbildung von Narbengewebe nach einer Gewebeverletzung stellt einen physiologischen Heilungsprozess dar, der notwendig ist, um die Funktionalität des Gewebes wiederherzustellen. Je nach Gewebetyp und der Art der Verletzung kann der Wundheilungsprozess unterschiedlich verlaufen. Zu den pathologischen Narben zählen sowohl hypertrophe Narben als auch Keloide. Hypertrophe Narben sind erhabene Narbengebilde, welche sich auf das ursprüngliche Wundareal beschränken. Morphologisch ähnlich zeigen sich Keloide, welche jedoch die Tendenz zeigen, die ursprüngliche Begrenzung des Wundareals tumorartig zu überwuchern und invasiv gesundes Hautgewebe zu infiltrieren (Broughton et al. 2006).Der genaue Pathomechanismus der Keloidentstehung ist jedoch noch nicht vollständig geklärt. Nachgewiesen ist, dass Strukturproteine wie Fibrin, Fibronektin und Glykosaminoglykane durch extrazelluläre Matrixproteine, hauptsächlich Kollagen, ersetzt werden. Außerdem zeigt sich sowohl die Aktivität von Fibroblasten als auch von inflammatorischen Zellen im Keloidgewebe erhöht. IGF-I-Rezeptor (insulin-like growth factor-I-receptor), TGF-beta (transforming growth factor), PDGF (platelet derived growth factor), CTGF (connective tissue growth factor), PAI-I (plasminogen activator inhibitor I) und HIF-I-alpha (Hypoxia inducible factor I alpha) sind prominente Zytokine, welche eine Rolle in der Pathogenese von Keloiden zu spielen scheinen (Altmeyer 2010).Aufgrund der bis heute weiterhin begrenzten Behandlungsmöglichkeiten stellen Keloide eine gravierende Dermatose dar, die die Lebensqualität betroffener Menschen stark beeinträchtigen kann. Die Entwicklung neuer therapeutischer Optionen und die Optimierung bereits bestehender Therapieoptionen setzt jedoch ein noch tieferes Verständnis der Pathophysiologie von Keloiden voraus. Daher war es Ziel dieser Arbeit, durch mondernste Methodik, der MultiAntigen-Analyse in Verbindung mit Bildanalysesoftware, unbekannte Prozesse und Zielstrukturen im Keloid zu identifizieren, auf die spezifische Pharmazeutika abzielen könnten.1.2 MethodenUm einen tieferen Einblick in diesen inflammatorischen Prozess zu erhalten, wurde im Rahmen der Forschungsarbeit „Multi-Antigen-Analyse zeigt inflammatorische DC, ADAM17 und Neprilysin als Effektoren bei der Keloidentstehung“ das Gewebe von 8 Keloid betroffenen Patienten untersucht, welche sich einer chirurgischen Intervention in der Hautklinik des 2 Universitätsklinikums Erlangen unterzogen haben. Von jedem Patienten wurden Proben aus dem aktiven Rand des Keloids und von angrenzendem makroskopisch nicht betroffenem Gewebe gewonnen. Zusätzlich wurden 5 Hautproben von nicht Keloid erkrankten Patienten untersucht. Anschließend wurden diese Proben mittels Multi-Antigen-Analyse (MAA) in Verbindung mit einem Data Mining Ansatz analysiert. Das Set der Multi-Antigen-Analyse beinhaltet 58 Antikörper mit 45 Immunzellmarkern, 5 Strukturmarkern und 8 Markern für Metalloproteasen und deren Substrate.Die MAA ist eine neuartige Technik zur Lokalisierung und Darstellung einer Vielzahl unterschiedlicher Antigenstrukturen in einem einzigen Gewebeschnitt, indem aufeinanderfolgende Sequenzen von Immunfluoreszenzfärbungen durchgeführt werden. Ein einzelner Gewebeträger wird unter ein Fluoreszenzmikroskop gelegt, das Teil der MELC Robotertechnologie ist. Dieser automatisierte und robotergestützte Prozess umfasst die Färbung des Gewebes mit markierten Antikörpern, einen Waschprozess der ungebundenen Antikörper und die Erstellung eines Fluoreszenzbildes je nach Antikörperfärbung. Nach Inaktivierung der Antikörper mittels Bleichverfahren startet eine erneute sequenzielle Runde der Immunfluoreszenzfärbung für einen weiteren Antikörper.Die zuvor aufgenommenen Fluoreszenzbilder wurden mit der StrataQuest Analysis Software© analysiert. Propidiumjodid (PI)-Färbungen wurden zur Erkennung von Zellkernen verwendet und ein vorhergesagter Zytoplasmasaum durch einen adaptiven Algorithmus hinzugefügt. Durch Überlagerung von PI-gefärbten Gewebeschnitten mit Antikörper-gefärbten Gewebeschnitten kann sowohl die quantitative Expression eines bestimmten Antigens als auch die genaue Anzahl der Zellen, die ein bestimmtes Antigen exprimieren, dargestellt werden. Außerdem kann durch Überlagerung mehrerer Gewebeschnitte die räumliche Anordnung verschiedener Antigenexpressionsmuster und Zellpopulationen zueinander darstellt und analysiert werden. Die räumliche Verteilung der Zellsubpopulationen wurde sowohl qualitativ als auch quantitativ mit Hilfe der K-Funktion von Ripley und Besag's L Funktion charakterisiert.Im Gegensatz zu herkömmlichen Immunfluoreszenzfärbungen, bei denen in der Regel lediglich ein Antigen pro Gewebeschnitt dargestellt wird, ermöglicht dieser Ansatz die Darstellung und Analyse von bis zu 100 Antigenen auf einem einzelnen Gewebeschnitt.1.3 Ergebnisse und Beobachtungen Konkordant zur aktuellen Studienlage konnte eine deutlich gesteigerte Zellularität im Keloidgewebe im Vergleich zur gesunden Kontrollhaut festgestellt werden. Neu ist jedoch, dass dies bereits im periläsionalen, makroskopisch nicht betroffenem Gewebe nachgewiesen werden konnte. Zudem dominieren vor allem von Monozyten abgeleitete inflammatorische dendritische Zellen (CD1a+, CD11c+, CD14+) und aktivierte CD4+ T-Lymphozyten (CD45 RO+) die Immuninfiltration im Keloidgewebe und sind zudem mit den im Keloid vorhandenen Fibroblasten assoziiert. Gleichermaßen zeigte das periläsionale Gewebe ein deutliches Immuninfiltrat im Vergleich zur gesunden Kontrollhaut. Interessanterweise dominieren vor allem Immunvorläuferzellen im periläsionalen Gewebe, welche sich perivaskulär konzentrieren, was darauf hindeuten könnte, dass diese von einem im Keloid vorhandenen Immunprozess angezogen werden. Normalerweise korreliert das Auftreten solcher Zellen mit einer Immunreaktion, die durch ein Antigen ausgelöst wird. Das Auftreten oder die Entwicklung von aktivierten Gedächtniszellen (CD4+ T-Lymphozyten (CD45 RO+)) würde eine solche Annahme unterstützen. Jüngste Studien haben zwar eine Vielzahl von inflammatorischen Zellen und Faktoren identifiziert, eine detaillierte Sequenz von Ereignissen wurde jedoch bisher nicht beschrieben. Die meistverwendete Methodik der klassischen Immunfluoreszenzfärbungen mit Darstellung einzelner weniger Antigene könnte hierfür ursächlich sein.Erstmalig beschrieben ist zudem, dass in Fibroblasten und Leukozyten im Keloidgewebe hohe Konzentrationen an Metalloproteasen ADAM10/17 und Neprilysin (CD10) nachgewiesen werden konnten. Die erhöhte Expression der Metalloproteasen fiel zudem mit dem Auftreten von Notch-Rezeptoren in Fibroblasten zusammen, welche Substrate von ADAM10 sind. Dies könnte auch mit einer stattfindenden Immunaktivierung korrelieren, da Metalloproteasen durch die Spaltung diverser Vorläufermoleküle zelluläre Differenzierung und Signalgebung induzieren. Die räumliche Nähe von Leukozyten zu Fibroblasten, die nur im Keloidgewebe durch Bildanalyse bestätigt werden konnte, könnte ein potenzieller Faktor der Fibroblastenaktivierung und der damit verbundenen exzessiven Kollagensynthese sein.

• Publisher: ProQuest Dissertations & Theses
• Subject: Antibodies / Antigens / Cellular biology / Cytokines / Dendritic cells / Extracellular matrix / Fibroblasts / Growth factors / Immunology / Leukocytes / Lymphocytes / Oncology / Pathogenesis / Physiology / Wound healing
• ISBN: 9798383063231